Innowacyjne pastylki z Nystatyną w leczeniu kandydozy jamy ustnej

Czy lokalne podawanie leków zwiększa skuteczność terapii?

Lokalne podawanie leków jest stosunkowo bezbolesną techniką, która dostarcza substancje terapeutyczne bezpośrednio do określonej tkanki, zwiększając ich skuteczność i zmniejszając działania niepożądane. Systemy dostarczania leków przez błonę śluzową jamy ustnej, takie jak pastylki do ssania, zapewniają bezpośredni kontakt związków z błoną śluzową jamy ustnej w celu leczenia chorób miejscowych i ogólnoustrojowych. Pastylki lecznicze to aromatyzowane i słodzone stałe postacie leku, zaprojektowane do ssania i utrzymywania w jamie ustnej, co zwiększa retencję załadowanego leku i poprawia jego biodostępność. Błona śluzowa jamy ustnej jest wysoce unaczynioną tkanką z bogatym ukrwieniem, co pozwala omijać podrażnienie żołądka oraz metabolizm pierwszego przejścia zarówno w żołądku, jak i w wątrobie.

Czas rozpuszczania pastylek w jamie ustnej zależy od pacjenta, który może kontrolować szybkość rozpuszczania, a następnie wchłaniania, kontrolując prędkość ssania pastylki, aż do jej całkowitego rozpuszczenia. Pastylki zazwyczaj potrzebują maksymalnie około 30 minut, aby całkowicie się rozpuścić. Mają one szeroki potencjał kliniczny, ponieważ mogą być wykorzystywane do dostarczania różnych składników aktywnych, takich jak środki przeciwkaszlowe, przeciwbólowe, probiotyki, szczepionki i antybiotyki.

Pastylki mogą być praktycznym i skutecznym wyborem leczenia zarówno dla dzieci, jak i osób starszych, będąc kolorowymi, smacznymi, atrakcyjnymi i wygodnymi. Jednak stosowanie pastylek leczniczych u dzieci i osób starszych wiąże się z wieloma wyzwaniami, takimi jak leczniczy posmak, który może wpływać na ich przestrzeganie zaleceń. Mogą również wystąpić potencjalne ryzyko przedawkowania i zadławienia.

Jak nanotechnologia Spanlastics wspiera dostarczanie Nystatyny?

Spanlastics to nano-pęcherzykowe systemy dostarczania leków składające się z czynników tworzących pęcherzyki i aktywatorów krawędziowych. Są to nośniki znane z wysoce elastycznej ściany błonowej, mogące dostarczać leki w sposób nieinwazyjny przez różne bariery błonowe. Są one ogólnie stosowane zarówno do miejscowego, jak i ogólnoustrojowego dostarczania leków, takich jak białka, peptydy i hormony. Nystatyna jest polienowym lekiem przeciwgrzybiczym o szerokim spektrum działania grzybobójczego i grzybostatycznego przeciwko kilku drożdżom i grzybom, zwłaszcza Candida. Nie jest wchłaniana z przewodu pokarmowego po podaniu doustnym. Dlatego preparaty miejscowe Nystatyny są najbardziej powszechne w przemyśle farmaceutycznym.

Niniejsze badanie przedkliniczne skupiło się na opracowaniu atrakcyjnego, aromatyzowanego twardego cukierka Spanlastical z Nystatyną do miejscowego leczenia kandydozy jamy ustnej, szczególnie u osób starszych i dzieci, u których kandydoza jamy ustnej występuje po leczeniu antybiotykami lub chemioterapii. Zapewnia on łatwość podawania, ulepszony smak, przedłużony czas przebywania w jamie ustnej i wysoką skuteczność przeciwgrzybiczą.

Czy optymalizacja parametrów wpływa na uwalnianie leku?

Nystatyna Spanlastics została przygotowana przy użyciu techniki wstrzykiwania etanolu. Osiem Spanlastics załadowanych Nystatyną przygotowano przy użyciu planu czynnikowego 2³, uwzględniając rodzaje Span, typ aktywatora krawędziowego i czas sonikacji kąpieli na dwóch poziomach. Dodano punkty centralne, aby potwierdzić nieistotność krzywizny wybranych modeli przy użyciu programu Design Expert-13®. Etanol został użyty do rozpuszczenia 10 mg Nystatyny (równoważnej mocy 5000 IU na mg) i 450 mg wybranego typu Span w łaźni wodnej o temperaturze 70°C. Roztwór etanolowy był wstrzykiwany kroplami za pomocą pompy strzykawkowej do fazy wodnej o tej samej temperaturze zawierającej 50 mg wybranego aktywatora krawędziowego z szybkością 1 ml/min. Stosunek fazy etanolowej do wodnej wynosił 1:4. Mieszaninę ciągle mieszano za pomocą mieszadła magnetycznego, utrzymując tę samą temperaturę, aż do utworzenia dyspersji wodnych SPs. Tak przygotowane dyspersje Nystatyna-Spanlastics o mocy 5000 IU/ml mieszano w temperaturze pokojowej do całkowitego odparowania pozostałego etanolu, a następnie poddawano sonikacji w łaźni wodnej w celu zmniejszenia rozmiaru pęcherzyków.

Przygotowane dyspersje Spanlastical Nystatyny miały kolor żółtawy ze względu na kolor samego surowca Nystatyny. Wszystkie preparaty były dyspersjami o akceptowalnym zapachu i łatwo rozpraszały się po wstrząśnięciu. Mętność była średnia (++) dla preparatów przygotowanych przy użyciu Span 60, podczas gdy mętność była duża (+++) dla preparatów przygotowanych przy użyciu Span 80. Ustalenia te mogą być spowodowane samym typem Span, ponieważ Span 80 ma nieco niższą wartość HLB (około 4,3) w porównaniu do Span 60 (około 4,7); to zmniejszenie wartości HLB może prowadzić do tworzenia mniej stabilnych dyspersji i może wystąpić rodzaj separacji faz, a tym samym zwiększona mętność.

Badania entrapment efficiency (EE%) wykazały, że wszystkie preparaty miały EE% wyższe niż 95%. Najwyższą efektywność enkapsulacji wykazała SP6, składająca się ze Span 60 i sodium deoxycholate (SDC), sonikowana przez 5 minut, podczas gdy SP7 była formułą o najniższej efektywności enkapsulacji; składała się ze Span 80 i Tween 20 i była sonikowana przez 3 minuty. Aktywator krawędziowy SDC ma dłuższy łańcuch alkilowy niż tween 20 (tzn. niższą wartość HLB i niższą masę cząsteczkową; wartości HLB Tween 20 i SDC wynosiły odpowiednio 16,72 i 16, a ich masy cząsteczkowe 1225 Da i 416,6 Da), więc Spanlastics przygotowane przy użyciu SDC wykazały zwiększone EE%. Stosowanie surfaktantów o wysokiej masie cząsteczkowej jako tween powoduje zakłócenie struktury dwuwarstwowej błony pęcherzyka, co zwiększa dyfuzję leku do medium wodnego podczas etapu wirowania, a tym samym zmniejsza EE% przygotowanych Spanlastics.

Wyniki pokazały również, że rodzaj wybranego środka tworzącego pęcherzyki może wpływać na EE% przygotowanych formulacji. Span 80 ma dodatkowy wydłużony łańcuch alkilowy niż Span 60. Ma nienasycenie w swojej strukturze, więc ma niską zdolność tworzenia pęcherzyków, co wpływa i zmniejsza jego EE%. W rezultacie formuły Span 60 wykazały wyższe EE% niż formuły Span 80. Ponadto zauważono, że zwiększenie czasu sonikacji kąpieli zwiększyło EE% ze względu na rozproszenie nanocząstek w otaczającym medium i zapewnienie dokładniejszego mieszania.

Czy wielkość cząstek i stabilność decydują o efektywności formulacji?

Pomiary rozmiaru cząstek (PS), wskaźnika polidyspersyjności (PDI) i potencjału zeta (ZP) wykazały, że zakres PS w (nm) wynosił od 202,2± 10,31 do 376,7± 41,9, zakres PDI od 0,259±0,022 do 0,405±0,075, a potencjał zeta w (mV) od −40,7±2,53 do −51,7±1,29. Najważniejszymi czynnikami, które umożliwiają pęcherzykom nośnikowym przekraczanie jakichkolwiek błon biologicznych, są ich ładunek, rozmiar i wskaźnik dyspersji. Czynniki te wykrywają zdolność pęcherzyka do przechodzenia przez maleńkie pory błon biologicznych. Mniejsze rozmiary pęcherzykowe, na przykład, mogą zapewnić głębszą penetrację barier biologicznych.

Zaobserwowano, że typ aktywatora krawędziowego wpływa na rozmiar pęcherzyka, ponieważ formuły zawierające aktywator krawędziowy SDC w połączeniu ze Span 80 (SP3) wykazywały mniejszy rozmiar pęcherzykowy niż te składające się z Tween 20 w połączeniu z tym samym typem Span (SP7). Stosowanie aktywatorów krawędziowych, takich jak SDC, o niższej wartości HLB w porównaniu do tween 20 (tj. niższej hydrofilowości) zmniejszy w konsekwencji energię powierzchniową pęcherzyka. W rezultacie uzyskuje się mniejszy rozmiar pęcherzykowy.

Zaobserwowano również, że przy ustaleniu wybranego typu aktywatora krawędziowego, Spanlastics Span 80 wykazywały mniejszy rozmiar niż preparaty Span 60, co może być spowodowane zwiększoną hydrofobowością Span 80 w stosunku do Span 60. Również zmniejszona swobodna energia powierzchniowa Span 80 może powodować zmniejszenie rozmiaru pęcherzykowego. Przedłużona ekspozycja pęcherzyków na sonikację kąpielową skutkuje małymi rozmiarami pęcherzyków.

Potencjał zeta i ładunek elektryczny pęcherzyków wpływają na stabilność przygotowanych Spanlastics. Jeśli potencjał zeta wynosi między (–) 30 mV a (+) 30 mV, system dyspersji może wykazywać niestabilność, taką jak flokulacja lub agregacja, spowodowaną przyciąganiem Van der Waalsa. Tak więc, im wyższe wartości ZP, niezależnie od ładunku, tym wyższa może być stabilność dyspersji. Wszystkie przygotowane Spanlastics Nystatyny wykazały ujemne wartości potencjału zeta przekraczające (–) 30 mV, co wskazuje na ich stabilność. Preparaty używały anionowego w naturze aktywatora krawędziowego jako SDC ma ładunek ujemny na powierzchni pęcherzyków. Posiadanie ładunku ujemnego uważa się za konieczne, ponieważ zwiększa to przepuszczalność pęcherzyka poprzez efekt sił odpychających między ujemnie naładowanymi pęcherzykami a powierzchnią bariery biologicznej, co pomaga im dyfundować głębiej i szybciej przez błony biologiczne niż dodatnio naładowane pęcherzyki. Formuły zawierające niejonowe surfaktanty jako tween 20 wykazują zmniejszoną ujemność tworzonych pęcherzyków.

Wskaźnik polidyspersyjności (PDI) jest wskaźnikiem jednorodności przygotowanych dyspersji pęcherzykowych. Wskazuje również, czy istnieje sprawiedliwy rozkład wielkości w formulacjach. Im mniejsze zgłoszone wyniki (tj. zbliżające się do zera), tym bardziej jednorodny jest rozkład. Stwierdzono, że tween 20 indukował mniejsze wartości PDI zarówno ze Span 60, jak i Span 80.

Na podstawie analizy statystycznej wyników i zgodnie z kryteriami (maksymalne EE%, maksymalne Q30%, minimalny rozmiar cząstek (nm), minimalny PDI i maksymalny potencjał zeta (mv) jako wartość bezwzględna), stwierdzono, że SP3 ma najwyższą pożądaną wartość (0,842), a następnie SP6 (0,705). Dlatego SP3 i SP6 zostały wybrane do zbadania ich aktywności przeciwgrzybiczej in vitro.

Jak formuła wpływa na działanie przeciwgrzybicze in vitro?

Badania aktywności przeciwgrzybiczej in vitro wykazały, że SP6 dała największą strefę zahamowania (32 mm ±0,2); jednakże jej blank również wykazał dużą strefę zahamowania wynoszącą (21 mm ±0,5), co może odzwierciedlać aktywność przeciwgrzybiczą samego Span 60. Aby wykryć rzeczywistą aktywność przeciwgrzybiczą Nystatyny w tym preparacie (rzeczywistą strefę zahamowania wywołaną przez sam czysty lek Nystatynę), odjęto strefę zahamowania blanku SP6 od strefy formuły SP6. Wtedy rzeczywista średnica strefy zahamowania wynosiła 11 mm. Natomiast formuła SP3 wykazała średnicę strefy zahamowania wynoszącą (26 mm ± 0,7), a jej blank nie wykazał aktywności. W rezultacie czysta strefa zahamowania uzyskana przez Nystatynę wynosiła 26mm. Ustalenia te skierowały uwagę na formułę SP3, ponieważ jej składniki najbardziej zwiększyły aktywność Nystatyny.

Strefy zahamowania wywołane przez różne stężenia zawiesiny doustnej dostępnej na rynku (Nystatyna) dały mniejsze strefy zahamowania niż SP3 i SP6. To badanie potwierdziło, że przygotowane Nystatyna Spanlatics (Sp3 i Sp6) o mocy 5000 IU/ml mają większą aktywność nawet niż formuła rynkowa, która zawiera 100 000 IU/ml, tj. to podejście skutecznie zmniejszyło dawkę około 20 razy przy podwyższonej aktywności. Formuła SP3 (która wykazała optymalną aktywność przeciwgrzybiczą in vitro), przy statystycznym porównaniu z różnymi badanymi stężeniami zawiesiny doustnej dostępnej na rynku (Nystatyna), wykazała istotną różnicę przy P ≤ 0,05. Dlatego SP3 została wybrana do włączenia do przygotowania stałych cukierków pastylek.

Czy pastylki twarde zapewniają optymalną prezentację leku?

Opracowano cztery serie twardych cukierków z Nystatyną Spanlastical, wykorzystując plan czynnikowy 2² z uwzględnieniem ilości syropu kukurydzianego i gumy ksantanowej jako zmiennych niezależnych na dwóch poziomach. Partie po sześćdziesiąt pastylek wytwarzano metodą ogrzewania i zestalania. W tej metodzie syrop cukrowy przygotowywano przez rozpuszczenie wymaganej ilości cukru w małej ilości wody, a następnie ogrzewano do 110°C, aż cukier się rozpuścił i dał przejrzysty, gęsty syrop. Powstały syrop cukrowy ogrzewano do 160°C, aż kolor zmienił się na złocistożółty. Następnie syrop pozostawiano do ostygnięcia do około 90°C. Następnie dodawano inne składniki, takie jak β-cyklodekstryna, mannitol, akacja, guma ksantanowa, syrop kukurydziany, celuloza mikrokrystaliczna, barwnik (Sunset yellow FCF E110) i olej aromatyzujący. Gdy temperatura stopionej masy spadła do około 40°C, do mieszaniny dodawano wymaganą objętość dyspersji Nystatyny Spanlastical. Każdą medykowaną stopioną masę następnie homogenizowano, równomiernie napełniano formy gumowe smarowane olejem słonecznikowym i pozostawiano do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.

W wybranej metodzie cukier jest uważany za główną bazę przygotowanych pastylek, ponieważ pomaga w tworzeniu struktury krystalicznej, która wspiera integralność pastylki podczas przechowywania i użytkowania. Syrop kukurydziany był używany jako środek słodzący i wiążący, aby zapobiec krystalizacji cukru, a także pomaga utrzymać przejrzystość i gładkość przygotowanych pastylek. Akacja była również używana jako środek wiążący. Beta-cyklodekstryna jest ogólnie używana do zwiększenia penetracji leku przez błonę śluzową oraz do łagodzenia bólu, zapalenia i gorączki. Może to być korzystne dla łagodzenia bólu towarzyszącego kandydozie jamy ustnej. Mannitol był używany jako rozcieńczalnik, który może dawać uczucie chłodzenia w ustach. Celuloza mikrokrystaliczna jest również używana jako rozcieńczalnik i dezintegrant. Guma ksantanowa jest hydrofilowym polimerem używanym jako środek spieniający. Olej słonecznikowy był używany jako smar. Aromat olejku pomarańczowego i kolor pomarańczowy dodano do każdej formuły, aby dopasować smak i wygląd preparatów.

Ocena wizualna wykazała, że przygotowane pastylki SPL1 i SPL2 miały błyszczący, półprzezroczysty wygląd, co może być spowodowane wysokim stosunkiem syropu kukurydzianego, podczas gdy partie SPL3 i SPL4 były lekko nieprzezroczyste. Ze względu na kształt formy pastylki były okrągłe z gładkimi krawędziami i głębokim rowkiem pośrodku. Wszystkie pastylki były pomarańczowe i lepkie w dotyku mokrymi rękami; także wszystkie przygotowane partie miały pomarańczowy zapach i słodzony pomarańczowy smak.

Średnica przygotowanych pastylek wahała się od 19,69± 0,000 mm do 19,80± 0,008 mm, a grubość pastylki od 7,90 ± 0,003 mm do 8,01± 0,001 mm. Ze względu na ograniczenia wymiarów formy, średnice uznano za jednolite. Waga przygotowanych pastylek różniła się między partiami ze względu na ich skład. Jednak pastylki w każdej partii były jednolite, a ich odchylenia wagowe mieściły się w akceptowalnym zakresie (tj. ± 5% średniej wagi partii) ze względu na równomierne napełnianie formy.

pH powierzchni przygotowanych pastylek wahało się od 6,85±0,12 do 6,92±0,06, co uznaje się za akceptowalne i niedrażniące dla błony śluzowej jamy ustnej. Zauważono, że pH powierzchni przygotowanych pastylek nie było zbytnio zależne od poziomów syropu kukurydzianego, ale było zmniejszone w partiach o wyższych poziomach gumy ksantanowej. Żadne konkretne badanie nie wykazało, że sama guma ksantanowa może znacząco zmienić pH preparatu. Jednak jej stężenie w pastylkach może wpływać na jej lepkość, a także na możliwość jej interakcji z innymi składnikami, co może pośrednio wpływać na ogólne pH produktu.

Twardość przygotowanych partii mieściła się w zakresie od 9,93 ± 0,18 do 10,56± 2,18 kg/cm2, co odzwierciedla dobrą wytrzymałość mechaniczną i zdolność do wytrzymania fizycznego i mechanicznego naprężenia podczas obsługi i przechowywania. Twardość przygotowanych pastylek zmniejszała się przy wysokich poziomach syropu kukurydzianego i zwiększała się przy wysokich poziomach gumy ksantanowej. Syrop kukurydziany jest higroskopijny i, gdy jest używany w wysokich stężeniach, może zwiększać zawartość wilgoci w matrycy pastylki, w konsekwencji zmniejszając jej twardość. Jednocześnie guma ksantanowa jest hydrokoloidem, który zwiększa lepkość pastylki poprzez tworzenie żelu, co może bezpośrednio wpływać na teksturę i twardość przygotowanej pastylki.

Kruchość przygotowanych partii wahała się od 0,248± 0,055% do 0,259± 0,028%, co mieści się w akceptowanym zakresie kruchości i wskazuje na doskonałą odporność mechaniczną wszystkich przygotowanych pastylek. Znaleziono odwrotnie proporcjonalną zależność między twardością pastylki a kruchością (tj. mniejsza twardość sprawia, że pastylki są bardziej podatne na kruszenie). Jak wspomniano wcześniej, syrop kukurydziany jest lepki, lepki i higroskopijny i może przyciągać i zatrzymywać wilgoć w wewnętrznej strukturze pastylki, co potencjalnie zmniejsza kruchość pastylki. Stwierdzono również, że kruchość zmniejszała się przy wyższych poziomach gumy ksantanowej.

Wskaźnik pęcznienia wszystkich przygotowanych partii po 3 godzinach wahał się od 54,63% ± 0,60 do 55,90% ± 1,92, wskazując na akceptowalną zwilżalność i dobre właściwości mukoadhezyjne. Stwierdzono, że wskaźnik pęcznienia przygotowanych pastylek zwiększał się przy wyższych poziomach syropu kukurydzianego niż gumy ksantanowej. Ponieważ syrop kukurydziany jest higroskopijny z natury, daje pastylkom wysoką zdolność do przyciągania i zatrzymywania wody.

Po zbadaniu naprężenia oddzielającego każdej partii, zgłoszone wyniki mieściły się w zakresie od 243,5±2,5 do 318±2,9 (dyna/cm²) ×10², co wskazuje na akceptowalny czas przebywania i dobrą mukoadhezję pastylek w jamie ustnej, nawet gdy są rozdrabniane przez zęby pacjenta. Poziom mukoadhezji przygotowanych pastylek jest wprost proporcjonalny do ich wskaźnika pęcznienia. Ta relacja może być spowodowana podwyższoną podatnością na hydratację, potencjalnie wpływającą na interakcję i adhezję między pastylkami a powierzchniami błony śluzowej jamy ustnej.

Zawartość leku w procentach wszystkich partii wahała się od 89,9±0,05% do 99,6±0,07% w/w, co nie przekracza specyfikacji IP 2007. Również zawartość leku przygotowanych pastylek Spanlastical była wysoka w preparatach o wysokich stężeniach syropu kukurydzianego.

Ponad 80% leku Nystatyna zostało uwolnione ze wszystkich partii po 30-minutowym badaniu uwalniania. Przygotowane pastylki wykazywały uwalnianie leku w zakresie od 83,6±0,7% do 92,1±1,2% w ciągu 30 minut. Procent uwalniania leku in vitro przygotowanych pastylek zwiększa się przy wyższym poziomie syropu kukurydzianego i gumy ksantanowej. Syrop kukurydziany jest higroskopijny z natury i w wysokich stężeniach tworzy bardzo lepką matrycę, która może przyciągać i zatrzymywać wodę. Ta cecha ułatwia szybszą szybkość rozpuszczania leku, gdy pastylka jest poddawana działaniu śliny w jamie ustnej, co z kolei może wpływać na charakterystykę uwalniania leku.

Guma ksantanowa jest hydrofilowym polimerem, który również odgrywa kluczową rolę w szybkości uwalniania leku z pastylek. Zwiększa lepkość formulacji poprzez tworzenie żelowej matrycy po uwodnieniu, co nie tylko pomaga w zatrzymywaniu wilgoci, ale także zwiększa mukoadhezję i przedłuża uwalnianie leku. Może również zapewnić kontrolowany wzorzec uwalniania poprzez tworzenie bariery żelowej, która stopniowo rozpuszcza się w ślinie. Gdy zarówno syrop kukurydziany, jak i guma ksantanowa są używane razem w formulacji pastylki, ich połączone efekty prowadzą do zwiększonego procentu uwalniania leku.

Jak potwierdzić zgodność leku i bezpieczeństwo technologii?

Widmo podczerwieni czystego leku Nystatyna wykazało znaczące piki przy podanych częstotliwościach w cm⁻¹: 3300 do 3500, 2968.45, 1708.93, 1571.99, 1436.97, 1398.93, 1068.56. Częstotliwość 3300 do 3500 cm⁻¹ wskazuje na rozciąganie (NH, OH), 2936 cm⁻¹ wskazuje na rozciąganie (C-H) (alifatyczne, alkan), 1702 cm⁻¹ wskazuje na drgania rozciągające grupy karbonylowej (C=O), 1577 i 1576 cm⁻¹ wskazują na jon karboksylowy (COOH), 1597 cm⁻¹ wskazuje na (C=C) (rozciąganie aromatyczne), 1490 i 1448 cm⁻¹ wskazują na (CH₂) (alkan), 1376 cm⁻¹ wskazuje na symetryczną deformację (CH₃), 1065 cm⁻¹ wskazuje na symetryczne rozciąganie (CH₃), a 999 i 962 cm⁻¹ wskazują na (=C-H) (aromatyczne, alken). Widmo podczerwieni mieszaniny fizycznej składników SP3L1 w stosunku (1:1) wszystkich składników wykazało podobne charakterystyczne piki czystego proszku Nystatyny przy ich odpowiednich długościach fal, co wskazywało na zgodność Nystatyny z innymi używanymi substancjami pomocniczymi.

Badania in vivo na szczurach przeprowadzono według egipskich przepisów Narodowego Laboratorium Zwierząt Laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Wydziału Nauk Farmaceutycznych i Produkcji Leków. Dwadzieścia cztery zdrowe szczury typu Wistar płci męskiej o średnim wieku 8 tygodni, ważące około 200g, zostały losowo przydzielone do jednej z czterech grup o równych rozmiarach (tj. sześć szczurów w każdej grupie) przy użyciu równoległego projektu eksperymentalnego. Szczury wszystkich grup były trzymane w przestronnych klatkach. Jako fotoperiody dzienne ustawiono dwanaście godzin światła i dwanaście godzin ciemności. Temperatura otoczenia była utrzymywana na poziomie 21°C przez cały czas. Dostęp ad libitum do żywności i wody był zapewniony dla wszystkich szczurów.

Jak model kandydozy jamy ustnej odzwierciedla skuteczność terapii?

Model kandydozy jamy ustnej został osiągnięty przy użyciu szczurów z obniżoną odpornością, aby zwiększyć wskaźnik zakażenia. Badanie przeprowadzono w ciągu trzech kolejnych tygodni; w tym okresie osiemnaście szczurów miało obniżoną odporność za pomocą deksametazonu i leczono tetracykliną, podczas gdy pozostałe sześć szczurów pozostawiono zdrowych i całkowicie normalnych. W pierwszym tygodniu (jeden tydzień przed rozpoczęciem indukcji zakażenia) osiemnaście szczurów otrzymało 0,5 mg/L deksametazonu i 0,1% tetracykliny w wodzie pitnej. Ósmego dnia (pierwszego dnia w drugim tygodniu badania) szczury otrzymały wyższą dawkę deksametazonu równoważną 1 mg/L i mniejszą dawkę tetracykliny do 0,01% w wodzie pitnej (i to było stosowane i utrzymywane przez cały eksperyment), oprócz bycia zakażonym doustnie przez trzy dni z 48-godzinnymi odstępami czasu (tj. dni 8, 10 i 12) przez 0,1 ml zawiesiny soli zawierającej (3×10⁸ CFU/ml) dwa razy dziennie.

Tuż przed rozpoczęciem inokulacji grzybiczej pobrano próbki od zwierząt, aby upewnić się, że C. albicans nie było obecne w ich jamie ustnej. Zakażenie było rozprzestrzeniane w jamie ustnej szczura przez toczenie wacika bawełnianego z zawiesiną Candida po wszystkich częściach jamy ustnej. Siedemdziesiąt dwie godziny po ostatniej inokulacji (tj. Dzień 14), próbki były zbierane od wszystkich podmiotów przy użyciu tej samej metody toczenia wacika bawełnianego, aby potwierdzić obecność grzybów, a także określić ilość i liczbę żywotnych komórek Candida w ich jamie ustnej przed rozpoczęciem procesu leczenia.

Trzy dni po zakażeniu (tj. Dzień 15) zakażone zwierzęta (n=18) zostały losowo podzielone na trzy grupy (każda po 6 szczurów), podczas gdy czwarta grupa (n=6) składała się z normalnych szczurów. Każda grupa otrzymywała inne leczenie dwa razy dziennie przez siedem kolejnych dni (od dnia 15 do dnia 21). Szczury z pierwszej grupy (Gp1) (n=6) były leczone optymalną pastylką Nystatyna Spanlastical (SP3L1) poprzez miejscowe rozprowadzanie jej drobno rozdrobnionego lepkiego proszku na języku szczurów dwa razy dziennie z wagami równoważnymi (0,3 mg Nystatyny/dawkę). Szczury z drugiej grupy (Gp2) (n=6) były leczone zawiesiną doustną dostępną na rynku (Nystatin®) poprzez aplikację zawiesiny z dokładną ilością dawkowania i protokołami schematu na języki szczurów. Szczury z trzeciej grupy (Gp3) (n=6) były używane jako kontrola pozytywna, ponieważ były zakażone, ale nieleczone zwierzęta. Zamiast terapii przeciwgrzybiczej otrzymywały równoważną objętość sterylnej soli fizjologicznej doustnie dwa razy dziennie (do używanych dawek soli fizjologicznej dodano 0,8% agaru, aby zwiększyć lepkość i czas przebywania). Zwierzęta czwartej grupy (G4) (n=6) były całkowicie normalne, otrzymywały te same objętości płynu sól fizjologiczna/agar i były używane jako kontrola negatywna.

Dwudziestego drugiego dnia, tj. 24 godziny po podaniu ostatniej dawki leczenia w każdej grupie, zwierzęta zostały poświęcone za pomocą przedawkowania etylowego uretanu. Języki szczurów były morfologicznie i wizualnie badane pod kątem jakichkolwiek oznak zapalnych lub infekcyjnych, następnie usunięte i starannie podzielone na sekcje prawą i lewą wraz z każdym policzkiem po stronie. Prawa sekcja każdego języka, wraz z prawymi policzkami, została użyta do przeprowadzenia badania mikrobiologicznego, ponieważ zostały zawieszone w 5 ml soli fizjologicznej i homogenizowane przez 10 minut w 25 000 RPM. Jeden ml każdego homogenatu został następnie poddany dziesięciokrotnym rozcieńczeniom seryjnym, a następnie równomiernie rozsmarowany na płytkach agaru Sabourauda Dextrose (SDA). Wszystkie płytki były inkubowane przez 24 godziny w 30°C, aby zwiększyć wzrost mikrobiologiczny, a następnie przeprowadzono ocenę ilościową przez liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU).

Czy przyszłe badania potwierdzą skuteczność innowacyjnych pastylek?

Badania in vivo na szczurach wykazały, że optymalna formuła (SP3L1) była bardzo skuteczna, ponieważ wykazała znaczne zmniejszenie liczby jednostek tworzących kolonie w jamie ustnej badanych szczurów. Wyniki morfologiczne i histopatologiczne również potwierdziły zwiększoną aktywność SP3L1, ponieważ szczury leczone nią wykazywały bardzo normalne tkanki jamy ustnej pod koniec okresu badania w porównaniu do tych leczonych formułą doustną dostępną na rynku (Nystatyna).

Liczba jednostek tworzących kolonie CA w badanych seryjnych rozcieńczeniach dziesięciokrotnych homogenatów jamy ustnej każdej grupy wykazała, że grupa kontrolna pozytywna wykazała (3×10⁶) ±22 CFU/ml, podczas gdy homogenaty grupy kontrolnej negatywnej wykazały ujemną hodowlę pod koniec eksperymentu. CFU homogenatów podmiotów z Grupy 1 (leczonych SP3L1) wynosiło (1×10³) ±10 CFU/ml, podczas gdy podmiotów z Gp2 (leczonych zawiesinę doustną Nystatina dostępną na rynku) wynosiło (2×10⁶) ±35 CFU/ml. Po statystycznym porównaniu logarytmu CFU czterech grup stwierdzono, że istnieje istotna różnica przy P ≤ 0,05 między SP3L1 a innymi terapiami (terapiami rynkowymi i kontrolnymi). To znaczne zmniejszenie żywotnej liczby Candida wskazuje, że optymalna formuła badania zwiększyła aktywność mikrobiologiczną Nystatyny przeciwko testowanemu szczepowi Candida.

Morfologia języków grup kontrolnych została użyta jako odniesienie. Języki grupy kontrolnej negatywnej były całkowicie normalne, podczas gdy języki grupy kontrolnej pozytywnej wykazywały zapalne białe plamy. Stwierdzono, że języki szczurów leczonych optymalną pastylką Nystatyna Spanlastical SP3L1 nie wykazywały oznak zakażenia lub zapalenia; w przeciwieństwie do tego, te leczone formułą rynkową (Nystatyna) wykazywały pewne zaczerwienienie i teksturalne oznaki zapalenia.

Stwierdzono, że badane tkanki szczurów leczonych SP3L1 (GP1) nie wykazywały oznak zmian zapalnych lub oznak zakażenia; nie wykazywały również obecności żadnych komórek Candida po zabarwieniu barwnikiem PAS. W przeciwieństwie do tego, grupa leczona rynkową zawiesiną doustną Nystatyny (GP2) wykazywała pewne przekrwienia, które odzwierciedlają niepełne gojenie; wykazywały również obecność komórek Candida po zabarwieniu barwnikiem PAS. Wyniki te mogą również wskazywać na zwiększoną aktywność przeciwgrzybiczą preparatu SP3L1 w porównaniu do formuły rynkowej.

Kandydoza jamy ustnej jest powszechna u dzieci i osób starszych, zwłaszcza tych, którzy byli leczeni przez długi okres antybiotykami lub chemioterapią. Obecne badanie przedstawia zoptymalizowaną mukoadhezyjną pastylkę twardą Spanlastical z Nystatyną do miejscowego leczenia kandydozy jamy ustnej. Formuła cukierka zapewnia atrakcyjną, słodką mukoadhezyjną prezentację nanoskalowej Nystatyny (Spanlastics) w jamie ustnej pacjenta. Charakterystyka in vitro, a także badanie in vivo na szczurach, ujawniły, że optymalna formuła (SP3L1) była bardzo skuteczna, ponieważ wykazała znaczne zmniejszenie liczby jednostek tworzących kolonie w jamie ustnej badanych szczurów. Wyniki morfologiczne i histopatologiczne również potwierdziły zwiększoną aktywność SP3L1, ponieważ szczury leczone nią wykazywały bardzo normalne tkanki jamy ustnej pod koniec okresu badania w porównaniu do tych leczonych formułą doustną dostępną na rynku (Nystatyna). Dlatego to podejście łączące nanotechnologię z mukoadhezyjnymi pastylkami może być obiecujące w leczeniu miejscowych chorób jamy ustnej, takich jak kandydoza, z ulepszonym smakiem, czasem przebywania i aktywnością.

Przyszłe badania kliniczne powinny być przeprowadzone w celu oceny i walidacji bezpieczeństwa i skuteczności pastylek Nystatyna spanlastical u pacjentów podczas długotrwałego stosowania. Powinny być również monitorowane wyniki zgłaszane przez pacjentów, takie jak złagodzenie objawów i poprawa przestrzegania zaleceń.

Podsumowanie

Badania wykazały, że zastosowanie nanotechnologii Spanlastics w pastylkach z Nystatyną znacząco zwiększa skuteczność leczenia kandydozy jamy ustnej. Wykorzystanie nano-pęcherzykowych systemów dostarczania leków pozwoliło na redukcję dawki leku przy jednoczesnym zwiększeniu jego biodostępności i aktywności przeciwgrzybiczej. Optymalna formuła SP3L1 wykazała znacznie lepsze właściwości terapeutyczne w porównaniu do konwencjonalnych form doustnych, co potwierdziły zarówno badania in vitro, jak i testy na modelu zwierzęcym. Pastylki charakteryzowały się dobrymi właściwościami mechanicznymi, odpowiednim pH i kontrolowanym uwalnianiem substancji czynnej. Dodatkowo forma pastylki zapewniła atrakcyjną, słodką prezentację leku, co może zwiększyć compliance szczególnie u dzieci i osób starszych. Badania histopatologiczne potwierdziły skuteczność i bezpieczeństwo opracowanej formulacji, wskazując na potencjał tej innowacyjnej technologii w leczeniu miejscowych chorób jamy ustnej.