Dlaczego nystatyna budzi zainteresowanie w terapii?
Nystatyna to polienowy środek przeciwdrobnoustrojowy o szerokim spektrum działania i stosunkowo niskiej oporności wśród patogenów grzybiczych. Te właściwości czynią ją jednym z najważniejszych leków w leczeniu opornych zakażeń grzybiczych u ludzi. Oprócz zastosowań przeciwgrzybiczych, nystatyna wykazuje aktywność leiszmanicydową in vitro zarówno wobec form promastigota, jak i amastigota kilku gatunków Leishmania, z udokumentowanymi pozytywnymi wynikami in vivo w modelu mysim BALB/c po zastosowaniu miejscowym. Nystatyna ma potencjał w miejscowym leczeniu zakażeń skórnych wywołanych przez wewnątrzkomórkowe patogeny leiszmanijne.
Strukturalnie nystatyna ma wydłużony kształt o długości około 2,8 nm i dużej masie cząsteczkowej (926 g/mol). Podobnie jak inne polieny, ulega chemicznej degradacji w kwaśnym pH (np. w żołądku) i słabo rozpuszcza się w wodzie i etanolu w temperaturze 24°C. Jej rozpuszczalność w metanolu jest nieco wyższa, ale nadal ograniczona z powodu tworzenia agregatów.
Ergosterol wzmacnia tworzenie kanałów transbłonowych nystatyny, co prowadzi do zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej, a ostatecznie do śmierci komórki. Ponieważ ergosterol jest głównym składnikiem błony komórkowej grzybów oraz błon niektórych kinetoplastydowych pierwotniaków, takich jak pasożytnicze Leishmania i Trypanosoma, efekt nystatyny w tych komórkach jest silniejszy niż w komórkach zwierzęcych czy roślinnych, w których kluczowym składnikiem jest cholesterol. Jednak nystatyna wykazuje również pewne powinowactwo do cholesterolu i może kumulować się w niektórych narządach, szczególnie w nerkach, prowadząc do umiarkowanej lub nawet ciężkiej toksyczności.
Dlatego nystatyna jest stosowana głównie miejscowo w leczeniu kandydozy błon śluzowych lub podawana parenteralnie w mniej nefrotoksycznych formulacjach liposomalnych do leczenia inwazyjnych zakażeń grzybiczych i leiszmaniozy, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością. Obecnie badane są doustne formulacje nystatyny do użytku systemowego, takie jak nanosuspensje i formulacje kochlearne. Te postępy mogłyby umożliwić pacjentom samodzielne podawanie leków w leczeniu układowych zakażeń grzybiczych.
Jak nystatyna oddziałuje na błony komórkowe?
Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których cząsteczki nystatyny wiążą się i tworzą kanały w błonie lipidowej, a także przechodzą przez nią, jest niezwykle istotne. Liczne badania analizowały wpływ nystatyny na błony lipidowe przy użyciu różnych technik mikroskopii fluorescencyjnej i fazowo-kontrastowej. Badania te koncentrowały się głównie na wiązaniu nystatyny z błonami i konsekwencjach jej agregacji wewnątrz nich. Stwierdzono, że nystatyna jest bardziej rozpuszczalna w błonach zawierających ergosterol niż w błonach zawierających cholesterol. Ponadto stopień wbudowywania nystatyny w dwuwarstwę lipidową wykazywał złożoną, nieliniową zależność od zwiększenia zawartości steroli w błonie.
Badania wykazały również, że przy wystarczająco wysokich stężeniach, nystatyna tworzy kanały selektywne względem wielkości cząsteczek w błonie lipidowej. Ich rozmiar zależy od liczby cząsteczek nystatyny obecnych w strukturze, a w konsekwencji od ogólnego stężenia nystatyny w błonie. Te kanały, składające się z 4-12 cząsteczek nystatyny, są strukturalnie podobne w błonach zawierających ergosterol i cholesterol, bez znaczących różnic w ich promieniach. Błony traktowane nystatyną są głównie przepuszczalne dla cząsteczek nie większych niż glukoza, która ma promień hydrodynamiczny około 0,4 nm.
Podczas gdy interakcja nystatyny z błonami komórkowymi została szeroko zbadana, mniej uwagi poświęcono jej zdolności do przechodzenia przez dwuwarstwę fosfolipidową, co pozostaje niejasne. Warto zauważyć, że transbłonowe przechodzenie nystatyny nie jest wymogiem jej działania przeciwdrobnoustrojowego, ponieważ może ona powodować śmiertelną nierównowagę gradientów elektrochemicznych już przez samą interakcję z zewnętrzną błoną komórkową. Jednak zrozumienie przechodzenia nystatyny przez błony mogłoby zwiększyć jej zdolność do celowania w wewnątrzkomórkowe stadia patogenów, takich jak amastigoty Leishmania i Trypanosoma oraz niektóre patogeny grzybicze, z większą wydajnością i specyficznością, a także dostarczyć cennych informacji na temat zmniejszenia jej działań niepożądanych w błonach zawierających cholesterol, na przykład w komórkach kanalików nerkowych.
Kluczowe właściwości nystatyny:
- Polienowy lek przeciwdrobnoustrojowy o szerokim spektrum działania
- Szczególnie skuteczny przeciwko patogenom grzybiczym dzięki interakcji z ergosterolem
- Działa poprzez tworzenie kanałów w błonie komórkowej (4-12 cząsteczek)
- Wykazuje również aktywność przeciwko pasożytom Leishmania i Trypanosoma
- Ograniczona rozpuszczalność w wodzie i wrażliwość na kwaśne pH
Jakie metody pozwalają zbadać działanie nystatyny?
Aby zbadać to zagadnienie, obserwowano zachowanie gigantycznych pęcherzyków wielopęcherzykowych (MVVs) po ich ekspozycji na roztwór nystatyny i porównano z zachowaniem jednopęcherzykowych gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUVs) poddanych działaniu tego samego roztworu. Każdy MVV składał się z zewnętrznego gigantycznego pęcherzyka jednowarstwowego (outGUV) i najczęściej jednego mniejszego gigantycznego pęcherzyka jednowarstwowego (inGUV) wewnątrz outGUV. Eksperymenty przeprowadzono z roztworami nystatyny o stężeniach 250 i 500 μM, przy których często dochodziło do pękania pęcherzyków. Różnice w czasie pękania między inGUVs a GUVs o porównywalnej wielkości zinterpretowano jako dowód na zdolność nystatyny do przechodzenia przez błonę outGUVs.
GUVy i MVVy przygotowano z mieszaniny palmitoilo-oleoilo-fosfatydylocholiny (POPC) i ergosterolu według zmodyfikowanej metody. Ergosterol zmieszano z POPC w stosunkach molowych 15:85 i 45:55. Mieszaniny rozpuszczono w roztworze chloroform-metanol 1:1, rozprowadzono na elektrodach platynowych i wysuszono w suszarce próżniowej. Elektrody umieszczono w komorze do elektroformacji wypełnionej 2 ml roztworu sacharozy 0,2 M. Zastosowano zmienne pole elektryczne, które stopniowo zmniejszano od wartości początkowej 1 V/mm i 10 Hz do wartości końcowej 0,1 V/mm i 1 Hz, co skutkowało tworzeniem się GUVów wypełnionych roztworem sacharozy.
Zawiesinę podstawową nystatyny o stężeniu 10 mM przygotowano z liofilizowanej nystatyny w czystym metanolu krótko przed eksperymentem. Roztwory nystatyny o stężeniach 250 i 500 μM przygotowano przez rozcieńczenie zawiesiny podstawowej roztworem glukozy 0,2 M i wymieszanie za pomocą mieszadła wirowego.
Pęcherzyki obserwowano za pomocą odwróconego mikroskopu przy użyciu techniki mikroskopii fazowo-kontrastowej. Obrazy były rejestrowane w sposób ciągły przy użyciu chłodzonej czarno-białej kamery CCD. Do manipulacji i obserwacji pęcherzyków użyto niestandardowej komory pomiarowej składającej się z dwóch oddzielnych przedziałów. Pierwszy przedział (przedział pęcherzykowy) wypełniono roztworem glukozy zawierającym pęcherzyki, a drugi przedział (przedział pomiarowy) wypełniono roztworem glukozy-metanol zawierającym nystatynę o stężeniu 250 lub 500 μM.
Ważne aspekty kliniczne:
- Główne zastosowanie: miejscowe leczenie kandydozy błon śluzowych
- Podawanie parenteralne w formie liposomalnej przy inwazyjnych zakażeniach
- Ryzyko nefrotoksyczności przy kumulacji w nerkach
- Stężenia terapeutyczne:
– 1-10 μM w narządach wewnętrznych
– do 35 μM we krwi po podaniu dożylnym
– do 200 μM przy aplikacji miejscowej - Trwają badania nad nowymi formulacjami doustnymi (nanosuspensje, formulacje kochlearne)
Co mówią wyniki eksperymentów z pęcherzykami?
Wyniki badań wykazały, że GUVy o końcowych promieniach większych niż 14 μm i outGUVy o podobnej wielkości wykazują porównywalne czasy pękania, natomiast GUVy o końcowych promieniach poniżej 14 μm wykazują znacząco krótsze czasy pękania niż inGUVy o podobnych końcowych promieniach. Co istotne, dla żadnego z obserwowanych MVVs inGUV nie pękł przed odpowiadającym mu outGUV, co wskazuje, że cząsteczki nystatyny nie mogą swobodnie przechodzić przez błonę outGUV.
Dane pokazują, że inGUVy spędzają średnio krótszy czas w roztworze głównym niż GUVy tej samej wielkości, niezależnie od składu błony. Przy stężeniach nystatyny 250 i 500 μM, czasy przebywania inGUVów w roztworze głównym były odpowiednio o 66% ± 25% i 45% ± 25% krótsze niż średnie czasy przebywania odpowiadających im GUVów. Różnice te były statystycznie istotne z dwustronnymi wartościami p poniżej 10^-4.
Należy również zauważyć, że różnica między czasami spędzonymi w roztworach nystatyny o stężeniu 250 i 500 μM jest mniejsza dla inGUVów niż dla odpowiadających im GUVów. InGUVy spędzają średnio o 27% ± 15% więcej czasu w roztworze głównym o stężeniu nystatyny 250 μM niż w roztworze głównym o stężeniu 500 μM. Natomiast odpowiadające im GUVy spędzają średnio o 107% ± 32% więcej czasu w roztworze głównym o stężeniu nystatyny 250 μM niż w roztworze o stężeniu 500 μM.
Pomiary promieni pęcherzyków w roztworach głównych o stężeniach nystatyny 250 i 500 μM wykazują średnio podobne krytyczne względne przyrosty promienia wynoszące odpowiednio 16% ± 7% i 19% ± 6% dla wszystkich typów pęcherzyków. Ze względu na stosunkowo duże odchylenia standardowe obserwowane w każdej grupie, różnice w krytycznym względnym przyroście promienia między różnymi typami pęcherzyków nie są statystycznie istotne.
Czy nystatyna przemieszcza się przez błonę?
Na podstawie wyników badań zaproponowano mechanizm umożliwiający przechodzenie cząsteczek nystatyny przez błonę fosfolipidową: niektóre monomery mogą oddzielać się od poszczególnych kanałów i przechodzić do roztworu po obu stronach błony. W konsekwencji indukowany jest pasywny przepływ netto cząsteczek nystatyny przez błonę ze strony o wyższym stężeniu nystatyny do strony o niższym stężeniu. Proponowany mechanizm przewiduje, że przechodzenie cząsteczek nystatyny przez błonę występuje tylko wtedy, gdy w błonie utworzone są kanały nystatynowe.
Proponowany mechanizm jest poparty eksperymentami przeprowadzonymi przy wysokich stężeniach nystatyny (powyżej 250 μM), gdzie tworzenie kanałów nystatynowych prowadzi do pęknięć pęcherzyków. Jednak wcześniejsze badania wykazały, że kanały nystatynowe tworzą się również przy znacznie niższych stężeniach nystatyny, poniżej 25 μM. Autorzy postulują, że mechanizm przechodzenia cząsteczek nystatyny przez błonę może działać przy niższych stężeniach nystatyny, gdzie nadal występuje tworzenie kanałów, chociaż pęknięcia pęcherzyków są nieobecne lub występują znacznie rzadziej. Te niższe stężenia nystatyny są często istotne fizjologicznie. Stężenia nystatyny w narządach wewnętrznych, takich jak nerki i wątroba, zwykle pozostają znacznie niższe – w zakresie 1-10 μM. Natomiast po podaniu dożylnym stężenia nystatyny mogą osiągać do 35 μM we krwi, a po aplikacji miejscowej poziomy mogą sięgać do 200 μM w górnych warstwach skóry lub powierzchniach błon śluzowych.
Rola ergosterolu polega na zwiększeniu rozpuszczalności nystatyny w błonie. W szczególności struktura błony, która zmienia się wraz z zawartością steroli, jest zaangażowana w rozpuszczalność agregatów nystatyny w błonie, ale kanały nystatynowe nie wymagają steroli do ich tworzenia. Ten efekt może być spowodowany złożoną, nieliniową dynamiką, jak sugerowano w poprzednich badaniach. Dlatego rola struktury błony zależnej od steroli jest kluczowa dla aktywności polienów.
Jakie są kliniczne implikacje badań nystatyny?
Na podstawie czasów pękania można oszacować dolną granicę przepuszczalności błony dla nystatyny, zakładając, że glukoza może swobodnie przechodzić przez błonę. Ta granica jest rzędu wielkości 0,1 μm/s, biorąc pod uwagę, że przepuszczalność błony dla nystatyny (P) jest zdefiniowana przez równanie j = P∆c, gdzie j jest gęstością strumienia cząstek przez błonę, a ∆c jest różnicą stężeń między dwiema stronami błony (prawo Ficka).
Zrozumienie mechanizmu przechodzenia nystatyny przez błonę fosfolipidową ma istotne znaczenie kliniczne. Może pomóc w opracowaniu skuteczniejszych terapii przeciwko wewnątrzkomórkowym patogenom, takim jak Leishmania i Trypanosoma, a także przyczynić się do zmniejszenia efektów ubocznych nystatyny w błonach zawierających cholesterol, na przykład w komórkach kanalików nerkowych. Transbłonowe przechodzenie nystatyny w komórkach kanalików nerkowych może zakłócać procesy w organellach subkomórkowych, takich jak mitochondria, i indukować apoptozę. Wiedza, że nystatyna przechodzi przez błonę, może zatem przyczynić się do opracowania bezpieczniejszych i skuteczniejszych formulacji terapeutycznych.
Badanie to dostarcza istotnych informacji na temat mechanizmów działania nystatyny i jej interakcji z błonami komórkowymi. Wyniki sugerują, że nystatyna nie tylko tworzy kanały w błonie, ale także może przez nią przechodzić, co ma znaczenie dla jej działania przeciwko wewnątrzkomórkowym patogenom. Zrozumienie tych mechanizmów może prowadzić do opracowania bardziej skutecznych i mniej toksycznych terapii przeciwgrzybiczych i przeciwpasożytniczych.
Podsumowanie
Nystatyna jest polienowym lekiem przeciwdrobnoustrojowym, szczególnie skutecznym w leczeniu zakażeń grzybiczych ze względu na niską oporność patogenów. Jej działanie polega na tworzeniu kanałów w błonie komórkowej poprzez interakcję z ergosterolem, co prowadzi do zaburzenia równowagi jonowej i śmierci komórki. Badania eksperymentalne z wykorzystaniem pęcherzyków lipidowych wykazały, że nystatyna może przechodzić przez błony komórkowe, ale proces ten zachodzi tylko przy obecności kanałów nystatynowych. Lek wykazuje większą skuteczność wobec błon zawierających ergosterol niż cholesterol, co tłumaczy jego selektywne działanie przeciwko patogenom. Ze względu na potencjalną nefrotoksyczność, nystatyna jest stosowana głównie miejscowo lub w formie liposomalnej. Prowadzone są badania nad nowymi formulacjami doustnymi, które mogłyby zwiększyć skuteczność i bezpieczeństwo terapii. Zrozumienie mechanizmu działania nystatyny ma kluczowe znaczenie dla rozwoju skuteczniejszych terapii przeciwko wewnątrzkomórkowym patogenom oraz zmniejszenia działań niepożądanych.
