Co nowego w metodach przeciwdziałania infekcji Candida auris?
Przedstawione badanie eksperymentalne stanowi pierwsze kompleksowe podejście do oceny skuteczności hydrożeli chitozanowych zawierających nystatynę i propolis jako ukierunkowanej strategii do miejscowej dekolonizacji skóry zakażonej przez Candida auris. Opracowanie nowych metod zwalczania tego patogenu jest szczególnie istotne, gdyż C. auris stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego ze względu na zdolność do długotrwałej kolonizacji skóry, przenoszenie w środowiskach opieki zdrowotnej oraz oporność na wiele leków przeciwgrzybiczych.
Badanie zostało przeprowadzone w warunkach laboratoryjnych z wykorzystaniem panelu dziesięciu szczepów Candida auris opornych na flukonazol, pochodzących z kolekcji Fungal Biodiversity Centre (CBS, Utrecht, Holandia). Identyfikację i charakterystykę szczepów potwierdzono za pomocą sekwencjonowania DNA i analizy MALDI-TOF MS. Testowano cztery formulacje hydrożeli: CS-NYS (chitozan z nystatyną), CS-PRO (chitozan z propolisem), CS-NYS-PRO1 i CS-NYS-PRO2 (chitozan z nystatyną i propolisem w różnych proporcjach masowych PRO/NYS – odpowiednio 3:1 i 6:1).
Analiza mikroskopowa z wykorzystaniem mikroskopii polaryzacyjnej (PLM) potwierdziła częściową dyspersję krystalicznej nystatyny w matrycy chitozanowej oraz amorficzny charakter propolisu. Hydrożele CS-NYS-PRO wykazywały mikrostrukturę łączącą regiony krystaliczne i amorficzne, co może przyczyniać się do synergistycznego efektu na poziomie mikrostrukturalnym.
- Formulacja CS-NYS-PRO1 (chitozan z nystatyną i propolisem) wykazała najsilniejsze działanie przeciwgrzybicze
- Osiągnięto niemal całkowitą eradykację C. auris w ciągu 6 godzin (redukcja >6-log10)
- Zaobserwowano największe strefy zahamowania wzrostu: 37,5 ± 1,18 mm
- Mikroskopia SEM wykazała 95% redukcję obszaru zajmowanego przez komórki grzyba
- Nystatyna wykazała silne wiązanie z enzymami C. auris (energia wiązania -9,436 kcal/mol)
Jakie rezultaty wykazują testy przeciwgrzybicze?
W testach dyfuzji na agarze wszystkie badane hydrożele wykazały aktywność przeciwgrzybiczą wobec C. auris, przy czym formulacja CS-NYS-PRO1 demonstrowała najsilniejsze działanie grzybobójcze, tworząc największe strefy zahamowania wzrostu (średnio 37,5 ± 1,18 mm). CS-NYS-PRO2 wykazywał nieco mniejsze strefy inhibicji (średnio 34,5 ± 1,51 mm), podczas gdy CS-NYS i CS-PRO charakteryzowały się umiarkowaną aktywnością (odpowiednio 28,3 ± 1,34 mm i 23,9 ± 1,29 mm). Analiza statystyczna potwierdziła istotne różnice między formulacjami (p < 0,0001).
Badania kinetyki zabijania (time-kill assay) wykazały, że hydrożele CS-NYS-PRO1 i CS-NYS-PRO2 osiągnęły niemal całkowitą eradykację C. auris w ciągu 6 godzin, redukując liczbę żywych komórek grzybów poniżej poziomu wykrywalności (<10 CFU/ml). Odpowiada to redukcji >6-log10 (ponad milionkrotnemu zmniejszeniu) żywotnych komórek grzybów w porównaniu z próbą kontrolną. CS-NYS sam redukował liczbę komórek o około 5-log10, podczas gdy CS-PRO wykazywał jedynie umiarkowaną redukcję o ~0,5-log10. Wyniki te sugerują synergistyczny mechanizm przeciwgrzybiczny między nystatyną a propolisem.
Obserwacje z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) ujawniły rozległe uszkodzenia morfologiczne komórek C. auris po ekspozycji na hydrożel CS-NYS-PRO1. Zaobserwowano nieregularne i zapadnięte morfologie komórkowe, chropowatość powierzchni, zahamowanie separacji komórek oraz wyciek zawartości cytoplazmatycznej z wielu komórek, co sugeruje poważne uszkodzenie błony komórkowej. Analiza ilościowa obrazów SEM potwierdziła redukcję obszaru zajmowanego przez komórki o ponad 95% po zastosowaniu hydrożelu.
Opracowane hydrożele chitozanowe z nystatyną i propolisem stanowią obiecującą, biokompatybilną alternatywę dla konwencjonalnych preparatów przeciwgrzybiczych. Jest to szczególnie istotne w kontekście zwalczania Candida auris – patogenu stanowiącego poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego ze względu na jego oporność na wiele leków, zdolność do długotrwałej kolonizacji skóry oraz łatwość przenoszenia w środowiskach opieki zdrowotnej.
Jak molekularne mechanizmy wpływają na działanie hydrożeli?
Badania dokowania molekularnego wykazały, że nystatyna wiąże się silnie z 14-alfa-demetylazą sterolu (CYP51) – kluczowym enzymem w biosyntezie ergosterolu, z energią wiązania -9,436 kcal/mol i stałą dysocjacji 0,121 µM. Nystatyna tworzyła liczne interakcje z 25 resztami aminokwasowymi receptora, głównie poprzez kontakty hydrofobowe, ale również tworząc 3 wiązania wodorowe. Dodatkowo, nystatyna wykazywała znaczące powinowactwo do reduktazy dihydrofolanowej (DHFR) z Candida auris, z energią wiązania -8,48 kcal/mol i stałą dysocjacji 0,611 µM, co sugeruje możliwy alternatywny mechanizm działania przeciwgrzybiczego.
Wyniki badań wskazują, że hydrożele chitozanowe zawierające nystatynę i propolis, szczególnie formulacja CS-NYS-PRO1, wykazują wyjątkowo silne działanie przeciwgrzybicze wobec opornych szczepów C. auris. Szybka i trwała aktywność grzybobójcza, potwierdzona badaniami strukturalnymi i molekularnymi, sugeruje potencjalne zastosowanie tych hydrożeli w miejscowej dekolonizacji skóry i zapobieganiu transmisji C. auris w środowiskach klinicznych wysokiego ryzyka.
Badanie to ma istotne implikacje kliniczne, oferując obiecującą, biokompatybilną alternatywę dla konwencjonalnych preparatów przeciwgrzybiczych, które często zawierają syntetyczne substancje pomocnicze mogące powodować miejscowe podrażnienia lub reakcje alergiczne. Dalsze badania powinny skupić się na ocenie tych hydrożeli w bardziej złożonych modelach skóry in vivo lub ex vivo oraz na optymalizacji formulacji pod kątem zastosowań klinicznych.
Podsumowanie
Przeprowadzone badania eksperymentalne przedstawiają kompleksową analizę skuteczności hydrożeli chitozanowych z nystatyną i propolisem w zwalczaniu Candida auris. Testowano cztery formulacje hydrożeli na dziesięciu szczepach C. auris opornych na flukonazol. Najskuteczniejsza okazała się formulacja CS-NYS-PRO1, która wykazała największe strefy zahamowania wzrostu (37,5 mm) i osiągnęła niemal całkowitą eradykację patogenu w ciągu 6 godzin. Badania mikroskopowe SEM potwierdziły rozległe uszkodzenia morfologiczne komórek grzyba, a analizy molekularne wykazały silne wiązanie nystatyny z kluczowymi enzymami C. auris. Wyniki sugerują, że hydrożele te mogą stanowić skuteczną, biokompatybilną alternatywę dla konwencjonalnych preparatów przeciwgrzybiczych w miejscowej dekolonizacji skóry.
