Przełom w terapii przeciwgrzybiczej: technologia LBL zwiększa skuteczność nystatyny

Czy nowatorska metoda LBL zmienia oblicze terapii przeciwgrzybiczej?

Badanie eksperymentalne przeprowadzone przez zespół badawczy wykazało, że zastosowanie nowatorskiej technologii powlekania warstwowego (LBL – layer-by-layer) w liposomalnych preparatach nystatyny znacząco poprawia skuteczność przeciwgrzybiczą tego leku. Naukowcy opracowali innowacyjną formulację wykorzystującą powłoki polielektrolitowe z chitozanu i alginianu w celu przezwyciężenia ograniczeń nystatyny, która należy do IV klasy BCS (niska rozpuszczalność i niska przepuszczalność).

Badanie zostało zaprojektowane jako eksperyment laboratoryjny oceniający różne formulacje liposomalne nystatyny. Analizowano zarówno podstawowe liposomy z nystatyną (Nys-Lip), jak i ich modyfikacje z pojedynczą warstwą chitozanu (Ch-Nys-Lip) lub alginianu (NA-Nys-Lip), a także formulacje dwuwarstwowe (LBL) o różnych proporcjach tych polielektrolitów. Głównym celem badania było określenie, czy takie modyfikacje mogą poprawić właściwości fizykochemiczne i aktywność przeciwgrzybiczą nystatyny.

Jak opracowano innowacyjną formulację liposomalną?

Badacze przygotowali liposomy metodą cienkowarstwowej hydratacji, wykorzystując lecytynę sojową i cholesterol (w stosunku 80:20) jako podstawowe składniki fosfolipidowe. Nystatyna (30 mg) została rozpuszczona w mieszaninie chloroformu i metanolu (1:1), a następnie odparowana w temperaturze 40°C przy użyciu wyparki obrotowej. Utworzona warstwa została poddana hydratacji przy użyciu buforu fosforanowego o pH 7,4 z dodatkiem 0,1% Tween 80 w temperaturze 60°C. Następnie przeprowadzono sonikację w celu redukcji wielkości cząstek do skali nanometrycznej.

Dla przygotowania liposomów pokrytych pojedynczą warstwą, zawiesinę pierwotnych liposomów dodawano kroplami do roztworów chitozanu lub alginianu. W przypadku formulacji dwuwarstwowych (LBL), liposomy pokryte chitozanem były następnie pokrywane alginianem w różnych proporcjach (1:1, 3:7 i 7:3). Wszystkie procedury powlekania były przeprowadzane przy pH 5,5, co zapewniało stabilność interakcji polimer-liposom.

Jakie są fizykochemiczne atuty preparatów liposomalnych?

Badacze przeprowadzili kompleksową charakterystykę przygotowanych nanocząstek, analizując wielkość cząstek, potencjał zeta, indeks polidyspersyjności (PDI), efektywność enkapsulacji (%EE), morfologię, uwalnianie leku in vitro oraz aktywność przeciwgrzybiczą wobec Candida albicans. Spośród wszystkich testowanych formulacji, liposomy powlekane warstwowo z proporcją chitozanu do alginianu 3:7 (NA7-Ch3-Nys-Lip) wykazały najlepsze właściwości.

Wyniki badania wykazały, że wszystkie przygotowane formulacje spełniały wymagania dotyczące wielkości nanocząstek (1-1000 nm). Podstawowe liposomy Nys-Lip miały wielkość 231,80 ± 12,97 nm, podczas gdy Ch-Nys-Lip osiągnęły 294,13 ± 21,24 nm, a NA-Nys-Lip 290,10 ± 4,76 nm. Formulacje LBL wykazały większe rozmiary: NA1-Ch1-Nys-Lip (524,07 ± 11,41 nm), NA7-Ch3-Nys-Lip (693,20 ± 4,02 nm) i NA3-Ch7-Nys-Lip (835,93 ± 33,7 nm). Potencjał zeta dla Nys-Lip wynosił -51,47 ± 0,19 mV, dla Ch-Nys-Lip +41,13 ± 0,90 mV, a dla NA7-Ch3-Nys-Lip -61,60 ± 2,54 mV, co wskazuje na wysoką stabilność tych systemów (wartości powyżej ±30 mV świadczą o bardzo stabilnych układach).

Indeks polidyspersyjności (PDI) dla wszystkich formulacji był poniżej 0,7, co świadczy o jednorodnym rozkładzie wielkości cząstek. Dla Nys-Lip PDI wynosił 0,33 ± 0,02, dla Ch-Nys-Lip 0,42 ± 0,01, a dla NA7-Ch3-Nys-Lip 0,50 ± 0,02. Obrazowanie za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) potwierdziło obecność dodatkowych warstw polielektrolitów na powierzchni liposomów.

Efektywność enkapsulacji (%EE) dla podstawowych liposomów Nys-Lip wynosiła 61,61 ± 1,60%, podczas gdy dla formulacji Ch-Nys-Lip wzrosła do 74,64 ± 1,54%. Formulacja NA7-Ch3-Nys-Lip osiągnęła najwyższą efektywność enkapsulacji wynoszącą 83,77 ± 1,39%, co stanowi znaczącą poprawę w porównaniu z podstawowymi liposomami.

Jak kontrolowane uwalnianie wpływa na skuteczność leku?

Szczególnie istotne były wyniki badań uwalniania leku i aktywności przeciwgrzybiczej. Niemodyfikowana nystatyna wykazała stosunkowo niski profil uwalniania, osiągając jedynie 21,37 ± 1,47% po 24 godzinach. Podstawowe liposomy Nys-Lip charakteryzowały się bardzo szybkim uwalnianiem (89,28 ± 2,67% po 12 godzinach). Formulacja NA7-Ch3-Nys-Lip wykazała kontrolowane uwalnianie nystatyny (13,60 ± 1,32% po 2 godzinach, 51,44 ± 3,29% po 8 godzinach i 64,17 ± 4,00% po 24 godzinach), co sugeruje, że powłoka chitozanowo-alginianowa zapewniała bardziej kontrolowane i przedłużone uwalnianie leku.

Co najważniejsze, minimalne stężenie hamujące (MIC) wobec Candida albicans dla formulacji NA7-Ch3-Nys-Lip wynosiło zaledwie 0,732 μg/mL, co stanowiło znaczącą poprawę w porównaniu z niemodyfikowaną nystatyną (23,44 μg/mL) i podstawowymi liposomami (1,465 μg/mL). Oznacza to, że formulacja LBL była około 32 razy bardziej skuteczna niż niemodyfikowana nystatyna i 2 razy bardziej skuteczna niż podstawowe liposomy.

Czy stabilność formulacji jest wystarczająca?

Testy stabilności wykazały, że formulacja NA7-Ch3-Nys-Lip zachowywała swoje właściwości fizykochemiczne przez 28 dni przechowywania, szczególnie w temperaturze 4°C, gdzie nie zaobserwowano istotnych statystycznie zmian w wielkości cząstek, potencjale zeta i efektywności enkapsulacji. Natomiast podstawowe liposomy Nys-Lip wykazywały znaczące zmiany tych parametrów w tym samym okresie, co świadczy o ich niższej stabilności.

Jakie mechanizmy zwiększają aktywność przeciwgrzybiczą?

Zwiększona aktywność przeciwgrzybicza formulacji LBL może być przypisana kilku mechanizmom. Powłoki polielektrolitowe zapewniają kontrolowane uwalnianie nystatyny, utrzymując jej stężenie terapeutyczne przez dłuższy czas. Ponadto chitozan, który jest jednym z komponentów powłoki, sam w sobie posiada właściwości przeciwgrzybicze, zaburzając błony komórkowe grzybów poprzez interakcje elektrostatyczne, co prowadzi do wycieku wewnątrzkomórkowego i ostatecznie śmierci komórki. Chitozan znacząco wzmacnia aktywność przeciwgrzybiczą wobec Candida albicans, szczególnie w połączeniu z innymi substancjami czynnymi.

Chociaż alginian nie wykazuje bezpośredniego działania przeciwgrzybiczego, przyczynia się do tworzenia stabilnej matrycy i poprawia penetrację leku do biofilmów grzybiczych, które często stanowią barierę dla terapii przeciwgrzybiczej. Ponadto formulacja ta zmniejsza działania niepożądane poprzez zapewnienie ukierunkowanego uwalniania leku z większą specyficznością do zainfekowanych obszarów.

Wyniki tego badania sugerują, że liposomy powlekane warstwowo mogą stanowić obiecującą platformę dostarczania leków przeciwgrzybiczych, potencjalnie prowadząc do skuteczniejszych interwencji terapeutycznych przy mniejszej częstotliwości podawania i dłuższym okresie przydatności do użycia. Dalsze badania in vivo są niezbędne do potwierdzenia skuteczności i profilu bezpieczeństwa tej nowatorskiej formulacji, a także do zbadania jej potencjalnych zastosowań z innymi związkami przeciwgrzybiczymi.

Podsumowanie

Przeprowadzone badanie eksperymentalne wykazało znaczącą skuteczność nowej technologii powlekania warstwowego (LBL) w preparatach liposomalnych nystatyny. Opracowana formulacja, wykorzystująca powłoki polielektrolitowe z chitozanu i alginianu w proporcji 3:7 (NA7-Ch3-Nys-Lip), wykazała najlepsze właściwości spośród testowanych wariantów. Charakteryzowała się wielkością cząstek 693,20 nm, wysoką stabilnością (potencjał zeta -61,60 mV) oraz efektywnością enkapsulacji na poziomie 83,77%. Kluczowym osiągnięciem było uzyskanie kontrolowanego uwalniania leku oraz 32-krotnie wyższej skuteczności przeciwgrzybiczej w porównaniu z niemodyfikowaną nystatyną. Formulacja zachowywała stabilność przez 28 dni w temperaturze 4°C, co wraz z pozostałymi parametrami czyni ją obiecującą platformą do dalszych badań nad nowoczesnymi terapiami przeciwgrzybiczymi.